Reagenzien RNS Rückseiten-Transkriptase RT-PCR schwemmen zuerst CDNA-Synthese-Ausrüstung R1011 R1012 an

Reagenzien RNS Rückseiten-Transkriptase RT-PCR schwemmen zuerst CDNA-Synthese-Ausrüstung R1011 R1012 an

Produktdetails:

Herkunftsort: China
Markenname: GDSBio
Zertifizierung: /
Modellnummer: R1011/R1012

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Min Bestellmenge: 1box
Verpackung Informationen: Päckchen oder Masse verteilen sich oder Soem
Lieferzeit: Tage 8work
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Versorgungsmaterial-Fähigkeit: 100 Kasten/Kästen pro Tag
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Detailinformationen

Katze. Nein.: R1011/R1012 Konzentration: R1011 (20 rxns), R1012 (100 rxns)
Auftritt: farblos Gruppe: Rück-Transkriptase PCR-Reagenzien
Tätigkeit: Durchlauf Verstärkungsfähigkeit: /
Logo Printing: Mit Logo Printing Transportverpackung: Verpackung
Produktionskapazität: 100 Kasten/Kästen pro Tag Lagerbedingungen: Speicher an -20°C
Markieren:

Logo Printing Funktelegrafie PCR-Reagens-Ausrüstung

,

Erste Synthese-Ausrüstung des Strang-CDNA

,

100 rxns Funktelegrafie PCR-Reagens-Ausrüstung

Produkt-Beschreibung

Funktelegrafie - PCR-Ausrüstung

Für nur Forschungsgebrauch

Cat No. R1011, 20 rxns

Cat No. R1012, 100 rxns

 

Komponenten der Ausrüstung

Komponente R1011 (20 rxns) R1012 (100 rxns)
M-MLV (200U/μl) μl 20 μl 100
RNasin (40U/μl) μl 12 μl 60
Oligo (Papierlösekorotron) 15 (50μM) μl 20 μl 100
Gelegentliche hexamer Zündkapsel (50μM) μl 20 μl 100
Erst-Strang 5× Puffer μl 80 μl 400
RNase-freies ddH2 O 1 ml 1 ml × 5
dNTPs (10mM je) μl 50 μl 250

 

Lagerung

Alle Komponenten der Ausrüstung sollten an -20°C. gespeichert werden halten Steuer-RNS an -70°C für längere Lagerung.

 

Beschreibung

RT-PCR Ausrüstung wird optimiert, um Erststrang cDNA von gereinigtem Poly zu synthetisieren (A)+ oder Gesamt-RNS. Die RT-PCR Ausrüstung für RT-PCR liefert erhöhte cDNA Erträge, hohe Empfindlichkeit und Abschriften in voller Länge in einem bequemen Format. Sie erhalten alle Komponenten, die Sie für erfolgreiche Erststrang cDNA Synthese benötigen, sparen Ihre Zeit und stellen Ihren Erfolg mit jedem Experiment sicher. Die Ausrüstung Rück-Transkriptase ist eine Version von M-MLV Funktelegrafie, die ausgeführt worden ist, um Tätigkeit der RNase H zu verringern und erhöhte Wärmebeständigkeit zur Verfügung zu stellen. Das Enzym wird benutzt, um cDNA an einer Temperaturspanne 42-55°C zu synthetisieren und stellt erhöhte Besonderheit, höhere Erträge cDNA und Produkt iner voller Länge als andere Rücktranskriptasen bereit.

 

Anwendungen

Erste Strang cDNA Synthese für RT-PCR

Bau von cDNA Bibliotheken

Ein-RT-PCR

Zündkapselerweiterung

 

Wichtige Anmerkungen

Vermeidung von Ribonucleaseverschmutzung

RNS-Reinheit und -integrität ist für Synthese von cDNA in voller Länge wesentlich. RNS kann durch RNase A vermindert werden, die ein in hohem Grade stabiler Schadstoff ist, der in jeder möglicher Laborumwelt gefunden wird. Alle Komponenten der Ausrüstung sind rigoros geprüft worden, um zu garantieren, dass sie RNase-frei sind. Um Verschmutzung zu verhindern müssen die die Laborumwelt und -reagenzien, alle vorbereiteten Lösungen von RNases frei sein. Allgemeine Empfehlungen, RNaseverschmutzung zu vermeiden:

  • DEPC-Festlichkeit alle Rohre und in cDNA Synthese verwendet zu werden oder Pipettenspitzen, des zugelassenen Nuklease-freien labware zu benutzen.
  • Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie RNS und alle Reagenzien behandeln, da Haut eine Sourceschaltung von RNases ist. Änderungshandschuhe häufig.
  • Benutzen Sie RNase-freie Reagenzien, einschließlich Wasser der hohen Qualität (z.B., DEPC-behandeltes Wasser).
  • Benutzen Sie ein RNasehemmnis, wie Dongsheng RNasin (#R2011) um RNS vor der Tätigkeit von RNases zu schützen.
  • Halten Sie alle Ausrüstungskomponenten versiegelte fest, wann nicht verwendet. Halten Sie alle Rohre schloss fest während der Rückübertragungsreaktion.

 

Schablone RNS

Die zelluläre TOTALRNS, die durch Standardverfahren lokalisiert wird, ist für Gebrauch mit der Ausrüstung passend. Gereinigte RNS muss die cDNA Synthesereaktion zu hemmen zu vermeiden von den Salzen, von Metallionen, von Äthanol, und von Phenol frei sein. Spurnschadstoffe können durch Äthanolniederschlag der RNS entfernt werden, die von zwei Wäschen der Kugel mit kaltem 75% Äthanol gefolgt wird. Für RT-PCR Anwendungen muss Schablone RNS von DNA-Verschmutzung frei sein. Vor cDNA Synthese kann RNS mit DNAse I behandelt werden, um Spurnmengen DNA zu entfernen. DNAse muss ich vom Benutzer erhalten werden. Führen Sie immer eine Steuer-(Funktelegrafie-minus) Reaktion durch, die alle Komponenten für RT-PCR außer dem Rück-Transkriptase-Enzym umfasst.

 

Verdauung der RNase-H

Die Empfindlichkeit des PCR-Schrittes kann (besonders für lange Schablonen) durch das Entfernen der RNS-Schablone vom cDNA erhöht werden: Hybrides Molekül der RNS durch Verdauung mit RNase H nach Erststrangsynthese. Vorhandensein von RNase H während der Erststrangsynthese vermindert die Schablone mRNA, mit dem Ergebnis verringerter cDNA Synthese in voller Länge und der verringerten Erträge Erststrang cDNA.

 

Zündkapseln

Synthese ersten Strang cDNA kann mit Oligo (Papierlösekorotron) Zündkapsel 15, gelegentlichen Zündkapseln oder Gen-spezifischen Zündkapseln vorbereitet werden entweder.

Oligo (Papierlösekorotron) 15 bereitet cDNA Synthese vom Poly vor (A) Endstückgeschenk am 3' - Ende von eukaryotic mRNA. Gelegentliche Zündkapseln leiten cDNA Synthese von der Gesamt-RNS-Bevölkerung ein (rRNA und mRNA). Deshalb unter Verwendung der gelegentlichen Zündkapseln für erste Strangsyntheseergebnisse in einer größeren Komplexität des erzeugten cDNA verglichen mit der Oligo (Papierlösekorotron) Zündkapsel 15. Als Folge die Empfindlichkeit möglicherweise und die Besonderheit von folgenden PCR-Reaktionen werden verringert. Jedoch gibt es einige Anwendungen, in denen es nützlich ist, gelegentliche Zündkapseln zu benutzen, wie cDNA Synthese unter Verwendung der mRNAs ohne ein Poly (A) Endstück oder cDNA Synthese unter Verwendung Poly (A) - angereicherte RNS-Proben.

Gen-spezifische Zündkapseln werden benutzt, um spezifisches cDNA von einem Pool von Gesamt-RNS oder von mRNA zu synthetisieren und müssen vom Benutzer erreicht werden.

 

Erstes- Verfahren Strang cDNA Synthese

Die erste- Strang cDNA Reaktion kann als einzelne Reaktion oder als Reihe parallele Reaktionen mit verschiedenen RNS-Schablonen durchgeführt werden. Deshalb kann das Reaktionsgemisch vorbereitet werden, indem man einzeln Reagenzien kombiniert, oder eine Vorlagenmischung, die alle Komponenten ausgenommen Schablone RNS enthält, kann vorbereitet werden. Abhängig von der Struktur der RNS-Schablone, unterschiedliche Schritte möglicherweise für RNS-Denaturierung und Zündkapselausglühen verbessern RT-PCR Ergebnisse.

Protokoll

I. Erste Strang cDNA Synthese

1. Fügen Sie die folgenden Reagenzien in ein steriles, Nuklease-freies Rohr auf Eis im angezeigten Auftrag hinzu:

Schablone RNS

Poly (A) mRNA

oder spezifische RNS

1-5 μg
Zündkapsel

Oligo (Papierlösekorotron) Zündkapsel 15

oder gelegentliche hexamer Zündkapsel

1 μl

1 μl

DEPC-behandeltes Wasser zu μl 12,4
Gesamtvolumen μl 12,4

2. Mischen Sie leicht, zentrifugieren Sie kurz und brüten Sie an 70°C für 5 Min. Schauer auf Eis, unten zu spinnen und die Phiole auf Eis zurück zu setzen aus.

3. Bereiten Sie die folgende cDNA Synthese-Mischung vor, fügen Sie die folgenden Komponenten im angezeigten Auftrag hinzu:

Puffer des Erststranges 5× μl 4
dNTPs (10 Millimeter jeder) 1 μl
RNasin 0,6 μl
M-MLV 1 μl

4. Mischen Sie leicht und zentrifugieren Sie kurz.

5. Für Oligo (Papierlösekorotron) 15 brüten Sie für Minute 60 an 42°C. aus. Für gelegentliches hexamer brüten vorbereitete Synthese, für Minute 60 an 37°C. aus.

6. Enden Sie die Reaktion, indem Sie an 70°C für 5 Min. erhitzen.

Das Rückübertragungsreaktionsprodukt kann sofort in den zweiten Strang cDNA Synthesereaktionen benutzt werden oder an -20°C für kleiner als eine Woche gespeichert werden. Für längere Lagerung wird -70°C empfohlen.

 

II. PCR-Verstärkung ersten Strang cDNA

Das Produkt der ersten Strang cDNA Synthese kann direkt in PCR oder im qPCR benutzt werden. Das Volumen des ersten Strang cDNA Synthese-Reaktionsgemisches sollte nicht enthalten mehr als 1/10 des Gesamt-PCR-Reaktionsvolumens. Normalerweise wird μl 2 des ersten Strang cDNA Synthese-Reaktionsgemisches als Schablone für folgenden PCR in 50 μl Gesamtvolumen benutzt.

 

M-Mlvrückseiten-Transkriptase Funktelegrafie-PCR

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